【技术名称】一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1方法

【应用行业】生物合成

【技术领域】基因工程和酶工程技术

【知识产权】发明专利

【成果完成单位】华中师范大学

【成果完成人姓名】贺红武、冯江涛、冯玲玲

【成果完成时间】2021-03-02

【专利号】CN202110229179.8

【授权日期】2023-02-03

【技术成熟度】已有样品

【应用背景】蓝藻是地球上最古老的物种之一，蓝藻丙酮酸脱氢酶的制备是研究其酶学性质、揭示丙酮酸脱氢酶定向分化等相关研究的基础，对研究以蓝藻丙酮酸脱氢酶为靶标的杀藻剂同样具有重要的科学意义。丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate Dehydrogenase complex,PDHc)催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2并为生物体提供能量。PDHc由三种不同的酶组份构成：丙酮酸脱羧酶E1(pyruvate decarboxylase,EC 1.2.4.1,PDHc E1)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶E2(EC2.3.1.12)和二氢硫辛酰胺脱氢酶E3(EC 1.8.1.4)。PDHc还包括一些辅因子焦磷酸硫胺素、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫辛酸和金属Mg2+等。PDHc 在生命活动中起着重要作用，缺乏PDHc会导致生物体内碳水化合物的代谢障碍，造成能量供应不足，引起与丙酮酸代谢异常相关的疾病。PDHc E1催化丙酮酸的氧化脱羧，其催化效率决定了整个酶联反应的速率，是整个酶联反应中的限速步和唯一不可逆步。

【成果简介】该成果涉及基因工程和酶工程技术领域，提供了一种制备异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1的方法，包括：先分别制备蓝藻丙酮酸脱氢酶PDHc E1的α亚基和β亚基所对应的DNA片段，然后将α亚基对应的DNA片段和β亚基对应的DNA片段分别克隆到pETDuet‑1载体的多克隆位点1区域和多克隆位点2区域，获得重组质粒pETDuet‑1‑α‑β；再将重组质粒pETDuet‑1‑α‑β和伴侣蛋白表达质粒pGro7共转化到同一宿主细胞中，得到pETDuet‑1‑α‑β‑pGro7重组宿主细胞；最后进行通过宿主细胞的培养，蛋白诱导表达，菌体收集，超声波破碎等蛋白表达分离纯化流程，即可获得异源四聚体α2β2型蓝藻PDHc E1。该成果提供的制备方法不受生物组织的限制，操作简单、高效、制备成本低，获得的蓝藻PDHc E1产量高、纯度高、活性高。

【成果图片】

【联系方式】段治国、安红高、刘树楠、吴涛，02767868068，02767868067